R. S. Pantelic, W. Fu, C. Schoenenberger, et al
摘要
无定形碳膜通常用于增强透射电子显微镜 (TEM) 中冷冻水合样品的制备，既可以保持蛋白质浓度，又可以提供机械稳定性，还可以消散样品电荷。然而，无定形碳载体的强背景信号会阻碍样品的信号，而薄无定形碳膜的绝缘特性又阻碍了电荷的分散。石墨烯克服了无定形碳的局限性。石墨烯是一种晶体材料，几乎没有相位或振幅对比度，却具有无与伦比的高电载流子迁移率。然而，石墨烯的疏水特性阻碍了其在冷冻透射电子显微镜 (Cryo-TEM) 中的常规应用。本通讯报道了一种使石墨烯 TEM 载体亲水化的方法——一种基于非共价芳香官能化来保持石墨烯结构和电学特性的便捷方法。
介绍
低温透射电子显微镜 (Cryo-TEM) 是指通过透射电子显微镜 (TEM) 对冷冻水合生物样本进行成像，从而将蛋白质复合物（和其他生物样本）的高级结构保存在接近天然状态。此外，通常使用薄（约 2 纳米）无定形碳膜（跨越原本独立的玻璃冰）来保持/促进单分散样品浓度。玻璃冰的刚性比无定形碳低 2 到 100 倍（根据对体积特性的测量），此外，由于束流诱导的辐射分解会在样品中产生局部内压，因此存在机械不稳定性。因此，也使用额外的无定形碳膜来提高机械稳定性（例如，通常用于 2D 蛋白质晶体）。电子束与样品的非弹性相互作用会释放俄歇电子和二次电子，产生净电荷。缓冲液中原本会传输/分散电荷的离子因玻璃化而被固定，从而导致局部电荷的积累。不移动的表面电荷会施加排斥性的库仑力，导致样品不稳定和/或引起微透镜效应，从而引发光束滞后（进一步损害成像稳定性）。额外的非晶碳膜被认为会给原本绝缘的玻璃样品放电。
与公认的原理相反，蒸发的薄非晶碳膜表面是电绝缘的，因此限制了样品电荷的耗散效率。尽管电导率会随着厚度超过约5.6纳米而线性增加，但体积的增加仍然无法补偿材料在低温下的半导体特性（降低电导率）。此外，即使厚度约为2纳米的非晶碳膜也会引入强背景信号（相位和振幅对比度），即使不能完全阻挡未染色分子的信号，也会衰减其信号。石墨烯直接解决了非晶碳膜的局限性。原始石墨烯的晶体结构在厚度低于 2.13 埃时几乎无相位对比。在约 0.34 纳米的单层厚度下，支撑物内部非弹性散射的振幅对比（噪声）也极小。其电导率比无定形碳（转换为本体单位，假设厚度为 3.4 埃）高出 6 个数量级以上，并且在低温下保持不衰减。因此，人们对石墨烯透射电子显微镜（TEM）支撑物的兴趣日益浓厚。
然而，由于缺乏合适的方法（即对晶体结构、透明度和电迁移率的衰减最小）和便捷的方法（印迹一致且可重复，无需专用设备），使石墨烯TEM载体具有亲水性，阻碍了石墨烯在冷冻透射电子显微镜（Cryo-TEM）中的广泛应用。我们报道了一种既便捷又能保持晶体结构、透明度和电性能的方法（分别通过拉曼光谱、冷冻透射电子显微镜和电学测量得到证实）。
通常通过等离子刻蚀，然后注入–OH、–COOH和C=O基团（例如）来使无定形碳载体具有亲水性。然而，入射离子溅射碳会破坏石墨烯的晶体结构，从而降低材料性能。诸如芘之类的芳香族分子对石墨烯具有很强的亲和力，它们通过稳定的π-π相互作用在基面上堆积，并包含多种官能团（例如-OH和-COOH），这些官能团已被用于制备碳纳米管和石墨的可溶性分散体。本文展示了如何在石墨烯TEM载体上制备冷冻水合生物样品，该载体采用非共价键预处理（不同于破坏底层结构的共价化学反应），并用1-芘羧酸（-COOH）进行芳香族官能化。
通过化学气相沉积 (CVD) 制备的石墨烯样品经过预蚀刻，并转移到硅晶片（带有300 nm热生长SiO2层）上进行拉曼和电学测量。在 300°C 下进行真空退火以去除所有痕量的聚甲基丙烯酸甲酯 (PMMA) 后，将样品在 1-芘羧酸 (-COOH，Sigma-Aldrich art. # 391581) 中放置过夜 (室温)，在 N,N-二甲基甲酰胺 (DMF，Sigma art. 227056) 中稀释至 100 mM 浓度，然后用乙醇彻底冲洗以防止干燥时沉淀污染。
图 1 显示了 1-芘羧酸功能化之前（黑色）和之后（红色）的拉曼表征（WITec Alpha300R 在室温下以 532 nm 激光激发操作）。典型的石墨烯结构以 ∼1360 cm−1、1560 cm−1 和 2700 cm−1 附近的拉曼峰为特征（分别为 ID、IG 和 I2D，黑色曲线）。IG 和 I2D 峰明显上移 ∼5.7 cm−1，以及 IG/I2D 比从 0.68 增加到 1.54，表明功能化后石墨烯被电子受体（例如 1-芘羧酸）p 型掺杂（红色曲线）。考虑到各个石墨烯样品之间经常会遇到的差异，在功能化之前和之后，将 100 个光谱的数据集映射到定义位置的 10 × 10 μm2 区域上。平均而言，在同一区域采样的 100 个光谱显示 IG 和 I2D 偏移一致，约为 3 cm−1，平均 IG/I2D 比率从 0.63 增加到 1.04。原始石墨烯可能表现出轻微的结构无序，如弱 ID 振幅所示（如此处所示，甚至在任何类型的功能化之前，黑色曲线），通常位于晶粒边界附近（例如）。然而，功能化后 ID/IG 比率从 0.09 到 0.17（平均 0.1 到 0.2）的微小增加进一步表明功能化主要为非共价/非破坏性模式（即掺杂）。最初可能被解释为 D 峰 (ID) 的增宽或 ID 与 IG 模式的合并（红色曲线），但在单独的拉曼实验（数据未显示）后，似乎出现了叠加的芘结构（灰色箭头），如 1234 cm−1、1387 cm−1 和 1629 cm−1 处的额外振幅/峰值所示。掺杂 1-芘羧酸可保持石墨烯独特性质所源于的晶体结构。
图 2 显示了用 1-芘羧酸功能化之前（黑色曲线）和之后（红色曲线）石墨烯场效应晶体管 (FET) 的电传输特性。使用电子束光刻技术从 Ti（5 nm）和 Au（60 nm）双层蚀刻源/漏电极。使用 Keithley 2600 A 源表在所谓的“线性区域”中以 10-50 mV 的低源漏电压 (Vsd) 进行电测量。该图显示了根据背栅电压 (Vg) 测得的电薄层电导 (G)。在功能化之前观察到双极晶体管特性（黑色曲线），反映了石墨烯中的载流子类型如何从空穴（p 型，左侧下降区域）连续调整为电子（n 型，右侧上升区域）。空穴 (p 型) 和电子 (n 型) 区域之间的过渡点 (所谓的电荷中性点，CNP) 位于薄层电导最小值处，在这种情况下，该值约为 29 V (Vg，在跨越 SiO2 基底的单层石墨烯的预期范围内)。功能化曲线 (红色) 的形状和梯度 (下降) 及其预期的 CNP 超过 40 V (Vg) 表明存在强 p 型掺杂，证实了拉曼的这种迹象 (图 1)。这里看到的高程度 p 型掺杂增加了空穴载流子浓度，提高了薄层电导 (G) 和石墨烯对电荷的有效分散。在强 n 型 (电子给体) 掺杂的情况下也会出现类似的情况。一般来说，随着空穴或电子浓度的提高，石墨烯的电导率预计会提高。电导（对于放电原本电绝缘的玻璃样品的能力至关重要）与石墨烯的载流子浓度和载流子迁移率的乘积成正比。载流子迁移率表征电子或空穴载流子穿过石墨烯的速度。在–COOH / Pyrene 功能化之前和之后，计算出的石墨烯 FET 的载流子迁移率仅从 2800 cm2 / Vs 略微变化到 2200 cm2 / Vs，比报道的无定形碳（<10−3 cm2 / Vs）高出许多数量级。结果表明，用 1-PyreneCarboxylic 酸进行非共价功能化可保持极高的载流子迁移率，从而保持石墨烯优异的电学性能，远远超过无定形碳。
在之前的工作中，我们确定了石墨烯 TEM 支撑架与薄（约 2 nm 厚）非晶碳膜相比具有高透明度，并寻求通过可比结果来限定这种优化方法。石墨烯 TEM 支撑架的制备如上所述。我们发现将网格放入在 N,N-二甲基甲酰胺 (DMF, Sigma art. 227056) 中稀释至 100 mM 浓度的 1-芘羧酸 (Sigma-Aldrich art. # 391581) 中孵育约 2 分钟就足够了。干燥之前，用乙醇彻底冲洗网格。烟草花叶病毒是一种高度有序的螺旋病毒，其周期性结构在约 23 Å 和约 11.5 Å 处分别表现出 3 阶和 6 阶层线（在平均功率谱密度中很明显）。衍射层线（包括较弱的阶次）的存在及其信噪比 (SNR) 可相对指示实际玻璃样品条件下的背景透明度。芳香功能化后无需进一步制备载体，将 4 μl 烟草花叶病毒 (TMV) 用缓冲液（50 mM Tris-HC、100 mM MgCl2、1 mM EDTA，pH 7.7）稀释至最终浓度为 ∼0.08 mg/ml，在网格上孵育 ∼2 分钟，然后进行印迹分析（FEI Vitrobot IV，1 s 印迹，印迹力 −5，20°C，100% 湿度），并浸入液态乙烷中。
用 1-芘羧酸进行功能化后，石墨烯支撑物上可观察到的印迹特性 (即表面张力降低) 发生了明显变化，在网格上留下了薄薄的水膜 (通过光学显微镜观察到)。 沿着箔方块边缘的连续印迹梯度 (图 3(a)) 与在常规处理的非晶碳网格上发现的一样，并表明在 Cryo-TEM 中印迹薄水膜所需的最小表面张力。 图 3(b) 显示在石墨烯上制备的玻璃化 TMV，用 1-芘羧酸进行非共价功能化。 在 -1.1 μm 离焦处成像，CTF 的理论零交叉不会抵消 3 阶 (∼23 Å)、6 阶 (∼11.5 Å) 和 9 阶 (∼7.7 Å) 层线。然而，如此近距离对焦成像通常会产生对比度特别低的图像（尤其是在对最薄的非晶碳进行成像时）。鉴于石墨烯的高透明度，单个 TMV 纤维清晰可辨。对显微照片进行归一化，并根据沿单个 TMV 纤维裁剪的部分（25%）重叠 512 × 512 像素区域计算平均傅里叶变换（共分析了 313 张显微照片，涵盖不同的区域和网格）。图 3(b) 的功率谱密度 (PSD)（图 3(c)，根据 9 个部分片段计算得出）不仅显示了高 SNR（分别为 3.75 和 2.4）的 3 阶和 6 阶层线，还显示了较弱的反射（1 阶、2 阶、4 阶和 5 阶）。平均而言，三阶和六阶层线的信噪比分别为3.1和1.19（分别由5个重叠段计算得出），与之前的结果相当。无论成像参数如何，非晶碳膜贡献的强背景信号（相位和振幅）都会阻碍低对比度玻璃化生物分子的信号。我们的结果表明，经1-芘羧酸功能化后，没有明显引入额外的背景信号。
尽管冷冻透射电子显微镜（Cryo-TEM）对石墨烯载体的兴趣日益浓厚，但疏水性这一根本问题却在很大程度上（甚至完全）被忽视了。石墨烯的惰性和疏水性使其无法吸附易于玻璃化的薄水膜。传统的等离子体处理通过破坏底层结构并注入氧离子和氢离子（例如共价功能化）使无定形碳载体变得亲水。石墨烯独特的成像特性源于其高度有序的晶体结构，而基面缺陷（例如通过共价功能化引入的缺陷）会严重削弱/降低其成像性能。因此，等离子体处理显然不适用于石墨烯载体的制备。尽管支撑无定形 Quantifoil 可能在某种程度上有助于保留少量缓冲液（即将样品施加到网格背面），但连续的水膜通常难以捉摸，因为仔细检查石墨烯通常只会发现部分玻璃状区域，石墨烯上的高表面张力将缓冲液限制为完全蒸发的载体中的小液滴。在石墨烯上沉积额外的无定形碳层可能适合等离子体处理，但会产生明显的背景噪音。在石墨烯上组装的任何类型的两亲单分子层（即洗涤剂、PEG 和其他聚合物）都会导致类似的信号衰减。延续以前的工作，我们报告了一种基于用 1-芘羧酸进行非共价芳香官能化的简便方法，通过该方法可以使石墨烯 TEM 载体具有亲水性，同时保持石墨烯的关键的上述特性。与苯酚和间苯三酚（-OH）等具有类似化学性质的分子相比，基于芘的分子更受欢迎，因为更大的芳香族分子能够更稳定地附着（从而提高一致性/可靠性）。
我们注意到，该方法的有效性取决于石墨烯载体的原始状态，因为严重的污染（无论是蚀刻还是转移残留物）都会干扰π-π电子相互作用（π堆积）。在转移石墨烯TEM载体的过程中进行彻底的蚀刻和清洁似乎可以充分解决这个问题。单颗粒分析研究依赖于复合物的随机取向，以便充分采样所有角度投影。因此，由于与蛋白质胺基的相互作用（例如）可能会引入复合物的优先取向，因此尚未考虑明确的蛋白质功能化。然而，各种芘化学结构（例如氨基芘）提供了一种获得特定表面亲和力的途径，这可能在未来的应用（例如EM样品的原位亲和纯化）中引起进一步的兴趣。
由于石墨烯的透明度和电迁移率几乎不会衰减，我们预计这种方法的简单性将促进石墨烯在常规装备的TEM实验室中更广泛地应用，以优化低温TEM样品。