原标题：Development of a micro-planar Ag/AgCl quasi-reference electrode with long-term stability for an amperometric glucose sensor
摘要
本文报道了一种具有长期稳定性的微平面 Ag/AgCl 准参比电极 （QRE），其特点是长期电位稳定性和对干扰物质的实际免疫力，并已应用于血浆葡萄糖的安培葡萄糖传感器。在制造过程中，我们首先用 γ-氨基丙基三乙氧基硅烷 （γ-APTES） 涂覆银/氯化银 （Ag/AgCl） 电极，然后涂覆全氟化碳聚合物 （PFCP）。测试表明，新电极能够在 150 mM KCl 中保持稳定 82 天，并且还表明其不受干扰物质（1 mM KI 和 1 mM KBr）、pH 值和血清的影响。此外，在血浆样品中葡萄糖浓度的检测中，使用临床分析仪获得的结果与使用开发的 Ag/AgCl QRE 的电化学葡萄糖传感器获得的结果之间显示出良好的相关系数 0.954 （n=30， Y=1.02X+0.20），表明 Ag/AgCl QRE 作为血浆样品的参比电极功能良好。
介绍
安培生物传感器的参比电极必须：（1） 显示能斯特方程的特性（即具有可逆反应的方程），（2） 具有长期电位稳定性，（3） 能够在电流流过后立即恢复其第一平衡电位，（4） 在温度循环中不引起电位滞后，以及 （5） 具有不会溶解在电解质溶液中的固态层。在这方面，含有饱和 KCl 的 Ag/AgCl 参比电极似乎很有前途。然而，这种电极存在一个问题，因为需要添加 KCl 意味着它们将非常昂贵且难以以生物传感器所需的更小尺寸制造。
已经有许多关于能够测量体内葡萄糖或乳酸的微型生物传感器的报道。其中一些传感器电极由小型化电极阵列组成，每个电极阵列包含一个工作电极 （WE）、一个对电极 （CE） 和一个参比电极，WE 和 CE 中使用铂。使用的参比电极是由在银表面制造的氯化银组成的 Ag/AgCl 电极。这些参比电极只能用于离子强度得到精确控制且不含任何干扰物质（即S-, I−和/或 Br−离子），Ag/AgCl 将直接与之反应。
据报道，对于Nafion®包被的Ag/AgCl参比电极，电位在植入后的2周内发生了大约-15 mV的偏移。虽然开发人员指出，这使得电极至少可以在这 2 周内使用，但他们并没有解决对更长可靠性的需求。
据报道，其他 Ag/AgCl 参比电极采用半导体工艺技术或微加工技术制造的玻璃或硅。这些电极不受离子强度变化的影响，也不会与干扰物质发生反应，它们的电位在饱和的 KCl 溶液中保持稳定数天，在此期间它们可以应用于微型生物传感器。
虽然这种设计提供了廉价的制造，但它似乎在未来与生物传感器一起使用的潜力很小。具体来说，Ag/AgCl 电极的相对短期稳定性（在饱和 KCl 溶液中仅可停留数天）和小型化程度的限制（由于玻璃和硅制造的技术限制）代表了这种设计的严重缺点。
针对这种情况，我们一直致力于开发一种微平面 Ag/AgCl 准参比电极 （QRE），该电极在电位方面具有长期稳定性，并且不会对 1 mM K 以外的干扰物质做出反应。我们在这里报告的电极具有全氟碳聚合物 （PFCP） 涂层，采用它的微平面安培葡萄糖传感器在血浆样品中葡萄糖浓度测试中表现出优异的准确性。
实验
试剂
葡萄糖氧化酶 （GOX，EC.1.1.3.4，比活性 506 IU 毫克−1） 由 Oriental Yeast（日本大阪）提供。牛血清白蛋白 （BSA）、10% （v/v） 戊二醛 （GA） 溶液、氯化钠 （NaCl）、氯化铁 （III）、氯化钾 （KCl） 和血清由 Wako（日本东京）提供，干扰物质（溴化钾 （KBr）、碘化钾 （KI） 和硫化钾 （K） 也是如此2N-三（羟甲基）甲基-2-氨基乙磺酸 （TES） 由 Dojindo Labs（日本熊本）提供。γ-氨基丙基三乙氧基硅烷 （γ-APTES） 由日本东京的 Shinetsu Chemical Industries 提供。Nafion 由 Aldrich（美国威斯康星州密尔沃基）以 5% （w/w） 溶液的形式提供。PFCP 由乙烯聚合而成，并在全氟化碳 （C®8F18) . 所有试剂均为分析级。
电极设计和准备
我们用于构建 Ag/AgCl QARE 和葡萄糖传感器的单芯片电极组如图1所示。它由一个 WE （7.18 平方毫米的面积）中，Ag/AgCl QRE （1.39 mm2面积）和由 CE（3.55 毫米2面积）由铂制成，全部在单个石英衬底上制造。WE 和 CE 由 300 nm 厚的铂层和 100 nm 厚的钛层组成。通过在 100 nm 厚的钛层上沉积 300 nm 厚的银层，然后用 50 mM 浓度的氯化铁 （pH 2.1） 对银层表面进行氯化，形成参比电极。钛用作石英衬底的铂和银的引物。
Ag/AgCl 准参比电极的制备
图 2 显示了 Ag/AgCl QRE 的横截面。覆盖这些电极的两层膜是通过首先旋涂 γ-APTES 溶液，然后是 PFCP 溶液来制造的，两者均以 3000 rpm 的速度旋转 30 秒。然后将所得参比电极固化 24 小时以上干燥，然后进行测试。γ-APTES 层是粘附在单芯片电极组和 PFCP 层上的粘附层。PFCP 层用作降低氯离子 （Cl−） 浓度，并用作阻断膜以防止干扰物质通过。
葡萄糖传感器制造
图 3 显示了横截面中的葡萄糖传感器。覆盖其电极的四层膜是通过旋涂 γ-APTES 溶液、Nafion 溶液、含有 GA 和 GOX 的 BSA 溶液以及 PFCP 溶液制成的。PFCP 层用作降低葡萄糖浓度的扩散膜。Nafion 层用作阻断膜，以防止干扰物质通过。
电化学测量
首先，在含有各种 Cl 的 100 mM TES 缓冲溶液中测试 Ag/AgCl QRE 和玻璃参比电极−浓度（KCl 浓度）或调整后的 pH 值。然后测量稳态电位值。玻璃参比电极由 Touwadenpa Industry（日本东京）提供。
为了测试 Ag/AgCl QRE 对干扰物质的敏感性，100 mM KBr、100 mM KI 和 100 mM K2S溶液将单独加入到 TES 缓冲溶液中，电极浸入其中。在 24±1 °C 下对 Ag/AgCl QREs 进行了测试。
葡萄糖传感器在 24±1 °C 的 1 mM TES 缓冲溶液中进行了测试，在 WE 和 Ag/AgCl QRE 之间施加了 +0.7 V 的恒定电位。当它们的背景电流稳定到 10-15 nA 范围内后，测量它们的稳态电流值。之后，将传感器浸入约 5 ml 的标准葡萄糖溶液和约 5 ml 的血浆样品中，并再次测量其稳态电流值。
结果和讨论
电位对氯离子浓度的依赖性
图 4 显示了 Ag/AgCl QRE 对 Cl 的潜在依赖性−浓度在 100 mM TES （pH 7.0） 中。在初始测量中（此处未显示），电位没有漂移;他们保持稳定。图 4 中绘制的数据表示经过 5 秒后测得的值。在 50 至 536 mM 的范围内，三种 Ag/AgCl QLE 的 Nernst 方程值分别为 −56.2、-58.3 和 −58.5 mV/10 倍。这些值（−57.7±1.27 mV/十倍频程）清楚地表明低色散。电极显示出明显的能斯特响应，并且准确地用作参比电极，这意味着只要控制离子强度，它们就可以用作参比电极。
干扰物质、pH 值和血清的影响
图 5 显示了 100 mM TES（150 mM NaCl，pH 7.0）溶液中 Ag/AgCl QRE 相对于干扰物质的电位。在图中，（a）、（b） 和 （c） 为 1 mM K2S、1 mM KI 和 1 mM KBr。无论有没有 PFCP 层，1 mM K2S 电位在 K 之后立即漂移到负电位2S 已添加到 TES 中。有 PFCP 层的电势在 30 s 内漂移到约 -20 mV，而没有 PFCP 层的电势在同一时间内漂移到约 -75 mV。使用 PFCP 层，1 mM KI 和 1 mM KBr 的电位在添加到 TES 后保持稳定。然而，如果没有 PFCP 层，KI 电位在 30 秒内漂移到 −2.0 mV，而 KBr 电位在这段时间内漂移到约 −17 mV。这些漂移表明 Ag/AgCl 与 S 反应2−我−和 Br−，即 Ag2S、AgI 和 AgBr。尽管 PFCP 层完全消除了对 1 mM KI 和 1 mM KBr 电位的影响，但它无法限制对 1 mM K 电位的影响2S.造成这种情况的主要原因似乎是 S2−离子，比 Br 小−和我−，很容易穿过 PFCP 层。
图 6 显示了 100 mM TES （150 mM NaCl） 溶液中 Ag/AgCl QRE 电位与 pH 值的关系。在 pH 5 到 pH 8 的范围内，有 PFCP 层的电位为 85.4±0.21 mV，没有 PFCP 层的电位为 84.9±0.17 mV。也就是说，PFCP 层的存在导致电位增加约 0.5 mV。无论有没有 PFCP 层，电位值在测试的 pH 范围内几乎保持不变。
图 7 显示了 Ag/AgCl QRE 相对于血清的潜在稳定性。如图所示，带有 PFCP 层的电极的电位随着时间的推移保持稳定;然而，没有 PFCP 层的电池在 50 秒内漂移到约 −20 mV。这表明 PFCP 层完全消除了对血清电位的影响。
然后，我们可以看到，参比电极对 1 mM K2S以外的任何干扰物质都没有反应，即获得的 pH 值和血清可用作血液和尿液葡萄糖的量度。然而，这些电极不能考虑用于含有高浓度Br−的样品还是I−，例如工业废水。
长期 Ag/AgCl 准参比电极性能
在评估Ag/AgCl QRE在饱和KCl（100 mM TES，pH 7.0）中的长期性能时，我们使用了Suzuki等采用的测量方法，因为其非常高的KCl浓度似乎非常适合加速长期性能测试。对于 PFCP 层，在第一阶段，5 小时后，电极的电位已从最初的 0 mV 漂移到正 3 mV 电位;在第二阶段，它从 5 h 点的 3 mV 逐渐漂移到 104 h 后的 −0.4 mV。最后，在第三阶段也是最后阶段，它从 104 h 点的 -0.4 mV 迅速漂移到 105 h 后的 -21 mV。第一级漂移率在正方向上为 0.6 mV/h;第二级漂移率在负方向约为 0.034 mV/h；负方向的末级漂移速率为 −20.6 mV/h。这表明 Ag/AgCl 在第一阶段没有与 KCl 溶液充分反应，但在第二阶段与 KCl 溶液反应正常。Ag/AgCl QRE 在最后阶段被迅速破坏。在没有 PFCP 层的情况下，电位仅短暂保持稳定，即从 1.1 mV 初始到 0.25 h 时的 1.0 mV;它从 0.25 h 时的 1.0 mV 下降到 2 h 后的 -44.0 mV。这种电位的快速漂移表明电极被破坏，是由于 Ag/AgCl 与 KCl 反应形成的复合物。
图 8 显示了电极在 150 mM KCl（100 mM TES，pH 7.0）中的长期性能，这近似于体内血液和尿液的浓度。对于 PFCP 层，电位在 82 天内逐渐从 81.0 到 73.3 mV，漂移率约为每天 −0.094 mV。然而，在没有 PFCP 层的情况下，电位漂移为负电位，从最初的 82.0 mV 漂移到 0.21 天后 （即约 5 小时）后的 -2 mV。
因此，PFCP 层似乎阻止了 AgCl 形成复杂的构型。带有 PFCP 层的 Ag/AgCl QRE 显示出优异的长期稳定性，足以满足实际使用需求。
血糖浓度的测量
图 9 显示了使用葡萄糖传感器测得的血浆葡萄糖浓度与使用葡萄糖-脱氢酶参比方法测试获得的血糖浓度。首先使用参比方法测量 4.33 至 12.9 mM 的血浆样品，然后使用葡萄糖传感器测量。将电极浸入 1 mM TES 缓冲液中，然后浸入样品中，然后再次浸入缓冲溶液中。重复这个循环，该过程在 60 到 90 秒的时间内进行。
虽然各自方法的结果之间的相关系数为 0.954 （Y=1.02X+0.20， n=30），但我们应该注意，如图 8 所示，大约有两三个样品的测量精度不尽如人意。测量所有血浆样品的总时间约为 35 min，即这些异常的原因似乎是这些特定血浆样品含有高浓度的干扰物质，可能是尿酸、抗坏血酸和/或对乙酰氨基酚。每个样品的平均时间约为 70 秒。
图 10 显示了测量前后为葡萄糖传感器获得的相应校准曲线。这些曲线在 0–27.8 mM 范围内显示出几乎完全的线性度，几乎相同。很明显，该传感器在测量 30 个血浆样品的葡萄糖浓度范围为 4.33 至 12.9 mM 时保持了良好的灵敏度。
此外，测量前后的 Ag/AgCl QRE 电位值几乎相同，在 150 mM KCl（100 mM TES，pH 7.0）中分别为 81.3 和 80.9 mV。同样明显的是，QRE 不受血浆样品的影响。
总结
我们开发了一种带有 PFCP 涂层的新型 Ag/AgCl QRE。它具有出色的长期稳定性，对血清、pH 值和干扰物质（1 mM KI 和 1 mM KBr）具有足够的实际抗扰度，并且成本低。它可以充分用作参比电极。在血浆样本的测试中，我们发现使用参比电极的葡萄糖传感器获得的结果与使用葡萄糖-脱氢酶参比方法的临床分析仪获得的结果具有良好的相关性 （0.954 （Y=1.02X+0.20， n=30））。