原标题：Electrochemical artifacts originating from nanoparticle contamination by Ag/AgCl quasi-reference electrodes
摘要
电化学技术依赖于定义的参考电位的稳定性。由于需要小型化，电化学芯片实验室平台通常采用 Ag/AgCl 准参比电极来实现此目的。在这里，我们报道了由标准氯化银丝引起的纳米颗粒-电极碰撞引起的电化学伪影。
介绍
电化学技术已广泛用于生物传感应用的芯片实验室社区。应用于芯片器件的电化学方法范围非常广泛，大量研究集中在电化学阻抗谱、循环伏安法和安培法上。所有这些技术通常采用三电极（工作电极、参比电极和对电极）或双电极（工作电极和组合参比电极和对电极）配置。生物传感器领域最常用的参比电极是 Ag/AgCl 电极。在传统的 Ag/AgCl 微电极中，Ag/AgCl 丝通常通过纳米多孔陶瓷或玻璃熔块从溶液中分离，并保存在规定浓度的 KCl 溶液中。由于熔块的原因，大分子或离子无法通过该屏障，从而在参比电极和样品溶液之间建立欧姆接触，从而限制化学交换。然而，由于方便和小型化的需求，所谓的准或伪参考电极经常用于片上生物传感器。与传统的 Ag/AgCl 参比电极不同，这些电极不与样品溶液隔离，因此在电位稳定性方面存在某些缺点。准参比电极以不同的形式制成，例如，压制的 Ag/AgCl 颗粒、氯化银丝（广泛用于电生理学）和通过银氯化制造的片上 Ag/AgCl 参比电极或可印刷的 Ag/AgCl 浆料。它们的小尺寸以及片上集成在微流体设备中的可能性使其成为实验室芯片生物传感器或 μTAS 平台中参比电极的完美候选者。
例如，已经在工作电极上测量了由细胞中产生动作电位引起的细胞外电位变化与参比电极的准稳定电位。因此，与准参比电极相关的较长时间的小电位漂移不会显着影响此类实验的结果，因为与时间尺度长得多的漂移相比，信号很快。然而，电极材料的电化学性质及其化学反应性可能在获得电压信号的形状中起重要作用。与电生理电压测量相反，电化学实验需要测量法拉第电流。这些可能是由氧化还原活性酶促反应或电极上化学或生化分子的直接氧化或还原引起的电子转移引起的。为了真正氧化或还原目标分子，工作电极必须分别偏置到高于或低于该分子的氧化还原电位的某个电位。反过来，这导致在此范围内具有氧化还原电位的所有物质的氧化或还原，最终导致总电流。电化学信号可能在广泛的时间尺度上表现出来。有时，实时检测到非常快速的信号，持续时间仅为几毫秒或更短。从突触或致密核心囊泡中释放氧化还原活性神经递质就是这样一个例子。通过氧化法拉第电流释放多巴胺的片上检测显示持续时间小于 1 ms 的电化学尖峰。因此，真正的细胞信号可能会受到具有相似时间特征的干扰电化学事件的影响。
在这项工作中，我们报告了与使用 Ag/AgCl 准参比电极相关的一种现象，正如我们所观察到的，它会干扰电化学测量并导致不可忽略的伪影。这些伪影归因于准参比电极的氧化还原反应和吸附/解吸过程，这些残基溶解在微电极阵列芯片顶部的溶液中。在进行了一系列研究实验后，我们得出结论，这些信号来自微电极处 Ag/Ag 纳米颗粒的直接氧化/还原。
实验部分
微电极阵列 （MEA）
在本研究中，我们使用了先前描述的微电极阵列 （MEA）。工作微电极由 Pt 或 Au （150 nm） 制成。整个芯片用 5 个交替的 SiO2堆栈进行钝化和Si3N4层（分别为 200 nm/100 nM）。每个芯片上有 64 个可单独寻址的电极（见图 1）。电极半径在同一芯片上相同（除了两个半径为 75 μm 的大电极），但不同芯片之间有所不同（从 1.5 到 10 μm）。通常，我们使用这些微电极阵列 （MEA） 来检测使用安培法或快速扫描循环伏安法 （FSCV） 检测芯片上生长的多巴胺能细胞释放的神经递质。
图 1： 64 通道微电极阵列。（A）MEA 带有储液芯，由粘在芯片顶部的玻璃环（20/5/1 mm：直径/高度/厚度）形成。（B）使用 62 个直径为 12 μm 的微电极和 2 个直径为 150 μm 的较大电极放大有源电极区域。
电化学实验
使用铂对电极 CHI 1030B 恒电位仪（CH Instruments Inc.，Austin，TX）在 3 电极配置中进行循环伏安法 （CV） 实验。实验在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中进行，所有 CV 实验均使用铂对电极。使用标准电化学氯化制备准参比电极。简而言之，将银线（Ø 0.008′′，A-M Systems，Sequim，WA）浸入 1 M HCl 溶液中，施加 +1.5 V 与 Pt 对电极的电位 60 秒，然后用去离子水彻底清洗。
进行安培实验以检测 Ag/Ag 纳米颗粒在与 MEA 微电极表面撞击时随时间变化的氧化/还原事件。为了以高时间分辨率对所有 64 个微电极进行并行测量，我们使用了低噪声电流放大器系统 PicoAmp64。在以前未接触过 Ag/AgCl 电极的芯片上进行测量。工作电极的电位每 10 秒在还原 （−0.3 V） 和氧化 （+0.6 V） 电位之间切换一次。将一根氯化银丝放入 MEA 顶部的储液器中，并重复测试方案数次。
电感耦合等离子体质谱 （ICP-MS）
在 ICP-MS 实验中，将 1 mL PBS 溶液置于先前暴露于 Ag/AgCl 丝的 MEA 芯片上。孵育 24 小时后，从芯片中取出液体并进行 ICP-MS 分析（ELAN 6100，PerkinElmer Inc.，Waltham，MA）以检测溶液中的金属残留物。
使用能量色散 X 射线光谱 （EDX） 的扫描电子显微复印 （SEM）
SEM 图像是使用配备 EDX 探测器的 Magellan XHR 扫描电子显微镜 （FEI， Hillsboro， OR） 拍摄的。电压和电流分别设置为 20 kV 和 0.4 nA。
动态光散射 （DLS） 测量
在 25 °C 下，在带有 632.8 nm HeNe 激光器和 ALV-5000 多 tau（τ）数字相关器（ALV，Langen，德国）的 ALV/CGS-8F 测角仪系统上进行动态光散射测量。 通过在 PBS 溶液中对氯化银丝进行超声处理来制备样品，然后通过平均孔径为 5 μm 的针式过滤器过滤。以 15 度的步长对 30 到 150 度的散射角进行测量，每个角度的测量时间为 150 秒。使用标准 ALV 软件进行连续拟合。请注意，考虑到颗粒的不规则形状（如在 SEM 中观察到的），这里给出的平均半径只是一个粗略的估计，因为分析假设的是球形颗粒，此外，半径的平均值是散射强度加权平均半径。
结果与讨论
在 CV 实验中，电位以 50 mV/s 的速率扫描从 −0.3 V 到 +0.6 V，首先是正方向，然后是反向。图 2 显示了使用商用 Ag/AgCl 参比电极（RE-6，BASi，英国凯尼尔沃思）在其中一个 MEA 微电极上进行的两个循环伏安图（图 2A），然后使用 Ag/AgCl 线作为准参比电极（图 2B）。
图2：单个 MEA 微电极上的循环伏安图和在峰处发生的拟议化学方程式。A.)使用商用常规 Ag/AgCl 参比电极测量的循环伏安图。B.)用氯化银线作为准参比电极测量的循环伏安图。扫描速率 50 mV/s.
在暴露于氯化银线之前，使用商用常规 Ag/AgCl 参比电极，获得干净的伏安图（图 2A）。没有法拉第峰或其他表明吸附/解吸效应的峰，仅存在由电极-电解质界面引起的电容电流和氧还原的开始。将芯片用作准参比电极或仅将其放入芯片上的溶液中，将芯片暴露于氯化银线后，伏安图上会出现清晰的峰值。在研究中测试了不同类型的参比电极，但在使用氯化银线准参比电极时观察到最强的伪影。如图 2B 所示，在前向扫描时在 +112 mV 处有一个明显的尖峰，在后向扫描上有一个更宽的峰值，覆盖了从 +87 mV 到 −26 mV 的电位。前向扫描峰值的振幅高达 0.8 nA，而后向峰值的振幅约为 0.1 nA。我们使用大约 20 个芯片和参比电极进行了实验，并在正向扫描期间观察到峰位置，分布范围为 +67 mV 至 +130 mV。前向扫描的峰值具有明显的尖锐形式，而后向扫描的峰值更宽，并且在 +42 mV 至 −94 mV 的电位范围内呈现最高幅度。我们在 CV 实验中将扫描速率从 50 mV/s 改变至 200 V/s并观察到峰电荷随扫描速率 （1.32 ± 0.13 pC-1V-1的函数而线性增加)。这表明测得的电荷不仅包括由于稳定吸附的银原子/离子氧化而产生的法拉第电流。
为了进一步研究这种现象，我们记录了监测污染过程随时间变化的电化学迹线。将导线放入 MEA 芯片并启动安培实验方案后约 1 分钟，在迹线中可以清楚地观察到阴极相期间的一些特征峰。几分钟后，峰值几乎出现在 MEA 的所有 64 个通道上。图 3 显示了暴露于氯化银丝 5 分钟后记录的单个微电极的痕迹。正如在代表性的安培迹线中可以清楚地区分的那样，在切换到负阴极电位之前，只有有限数量的峰。这确实是不同芯片上所有其他电极上的情况：在 +0.6 V 的阳极电位处出现极少的相当小的峰值（振幅约为 0.1 nA）。切换到阴极电位后，立即出现多个振幅范围从低于 1 nA 到超过 10 nA 的峰值。阴极峰在切换到 −0.3 V 电位后 5 到 10 秒几乎消失。不同通道上的峰在时间上不相关，这表明这些确实是独立的电化学事件。进行安培实验后，使用 CV 研究单个微电极，并记录与图 2 中所示相似的峰。在未暴露于氯化银丝的芯片上未观察到上述瞬态峰。ESI 显示了未污染的 MEA 与可靠的常规 Ag/AgCl 参比电极或甘汞参比电极的比较安培测量结果，如图S1和S2所示。
图3 暴露于 Ag/AgCl 丝的 MEA 的安培测量。在阳极电位和阴极电位之间切换。A.)具有 3 个阳极/阴极循环的轨迹。B.)在 +0.6 V. C. 处放大阳极部分。放大 −0.3 V 的阴极部分。插图：单个安培峰的示例。
我们使用 ICP-MS 作为验证使用电化学技术观察到的纳米颗粒化学成分的方法。分析了先前暴露于氯化银丝的MEA芯片中的液体。发现高浓度的 Pt 和 Ti （参见表 S3），它们是电极和粘附层的基材。列表中浓度第二高的元素是银，这加强了我们的假设，即测量信号是由来自 Ag/AgCl 准参比电极的纳米颗粒引起的。其他元素可归因于来自靶材或靶材支架或用于金属沉积的物理气相沉积室壁的污染物。
未受污染的 MEA 和暴露于 Ag/AgCl 丝的 MEA 使用 SEM 进行额外的表面分析，同时使用 EDX 检测器进行基本分析。我们分析了三种对 Ag/AgCl 丝具有不同暴露时间的芯片：长（超过 5 小时和额外的清洗步骤）、短（10 分钟）和无暴露。所有芯片都经过了多个 CV 测试，但只有前两个芯片表现出特征峰。使用 EDX 对受污染的微电极表面进行基本分析，发现构成微电极和钝化表面的其他预期元素中存在银（参见图 S4、S5）。图 4 中可以看到带有 Ag 沉积物的受污染电极的 SEM 图像。图 S6中显示了一个干净、未受污染的电极。
图4：暴露于 Ag/AgCl 丝的单个 MEA 微电极 （Ti/Au/Ti） 的 SEM 图像。（A）长时间暴露后的微电极。插图：放大粒子的聚集体。（B）短暂暴露 10 分钟后的微电极。插图：放大单个粒子。
我们将实验中观察到的峰归因于氧化还原反应以及从氯化银丝产生的 Ag/AgCl 纳米颗粒插入溶液后产生的 Ag/Ag 对的吸附/解吸过程。最有可能的是，Ag/AgCl 丝的溶解是由离子的化学梯度和丝表面的机械不稳定性引起的，因为当丝不是电化学装置的直接部分（被动插入溶液）时，也会观察到这个过程。我们研究中展示的峰与最近报道的银纳米粒子-电极碰撞事件的峰相似。这种现象在电化学界越来越受到关注，并受到 Compton 小组和其他小组的广泛研究。例如，在周等人的工作中，使用电位约为 +100 mV 的玻璃碳微电极对银纳米颗粒进行氧化。单个纳米粒子的电流振幅约为 0.1 至 1 nA，类似于我们在工作中观察到的。在我们的实验中观察到的更宽范围的阳极电位（+67 mV 至 +130 mV）很可能是由于源自 Ag/AgCl 线的不同尺寸的银纳米颗粒的氧化。
如果我们假设纳米颗粒在与电极接触时呈球形完全氧化，则可以使用以下公式从测得的电荷中计算出颗粒的半径：
其中 Qmax是测得的电荷，F 是法拉第常数，ρ 是堆积密度，Ar是相对原子质量。根据方程 （1） 和从 10 个不同芯片获得的数据，检测到的纳米颗粒的平均等效半径为 104 ± 7 nm （n = 76，误差是平均值的标准误差）。检测到的最小颗粒的半径仅为 3.0 nm（可能是真正的单个纳米颗粒），而最大的颗粒或可能的聚集体37计算出的半径为 250 nm（很可能是多个颗粒或聚集体）。此外，还使用动态光散射 （DLS） 测量分析了颗粒粒度，显示粒径分布较宽，峰半径范围为 148 至 190 nm，具体取决于散射角 （S7颗粒球形的假设并不完全准确，因为可以在广泛使用的芯片的 SEM 图像上观察到纳米颗粒的聚集体（见图 4）。此外，SEM 图像支持这样假设，即测得的电荷不仅代表单个颗粒，还代表多个颗粒或颗粒聚集体。因此，在比较实验中检测到的信号时，我们还使用测得的电子数，它与氧化/还原的银原子/离子的数量成正比，可以直接从测得的电荷中得出：
根据方程 （2） 的每个检测到的事件的平均电子数或可能的银原子/阳离子数为 5.73 × 108± 0.97 × 108 (n = 76，误差是平均值的标准误差）。检测到的最小颗粒仅含有 6.3 × 103原子，而较大的粒子或粒子聚集体的 3.79 × 109原子。
总结了在本研究范围内进行的不同实验的所有发现，我们得出结论，在电化学测量过程中，微电极上记录的峰的最可能解释是 Ag/AgCl 纳米颗粒与电极表面的碰撞。颗粒来自暴露于溶液的准参比电极的 Ag/AgCl 丝。似乎，当电极保持在阴极电位时，颗粒向电极扩散，与微电极表面接触，首先从Ag+还原为Ag0。在最初的 5-10 秒内，在安培图上的阴极电位处经常观察到频繁的还原峰，这支持了这一论点。在这个初始阶段之后，最靠近电极表面的溶液层的阳离子耗尽，还原事件的频率急剧降低。我们还认为，还原后，大多数颗粒被吸附在电极表面。CV 上相当宽的阴极峰支持了这一点，它代表了还原反应和吸附过程的组合，表现为电极电容随时间增加。证实吸附假说的另一个方面是，当电位切换到 +0.6 V 时，只检测到几个氧化峰。如果银颗粒成为电极的一部分，在电位切换后，它们几乎瞬间被氧化成银阳离子，银阳离子要么被羟基稳定，要么可能形成银氧化物 （Ag2O） 或氯化物 （AgCl） 的 Pod S 的 S在这种情况下，氧化发生在电位开关后的第一刻，在所谓的盲时间期间，由电容充电诱导，此时无法检测到信号。之后，只出现零星的峰，可能来自一些在还原过程中没有被吸附或直接来自银丝的银颗粒。此外，循环伏安法过程中的尖锐阳极峰（图 2）表明电极表面的银沉积物瞬时氧化。38在氧化过程中，一些颗粒可能会从电极上解吸。然而，基于微电极污染的永久性，要么不是所有的颗粒都被解吸，要么解吸的颗粒没有扩散到远离电极的地方，而是再次被吸引到表面，这可能是由于反向扫描时的静电相互作用。ICP-MS 分析显示，暴露于被 Ag/AgCl 纳米颗粒污染的芯片的溶液中明显存在大量银。此外，SEM 图像显示，在连续暴露于 Ag/AgCl 丝后，银矿床聚集。
结论
在这项工作中，我们展示了来自氯化银的银原子/离子与用作准参比电极丝的银原子/离子与 MEA 微电极表面碰撞产生的电化学伪影。需要对这种现象进行进一步研究，以完全了解所研究系统中发生的氧化还原反应和吸附/解吸过程。尽管如此，我们想在这项工作中传达的信息是，在使用 Ag/AgCl 准参比电极进行电化学检测时必须特别小心。特别是对于片上应用，准参比电极集成在芯片或微流体系统中，应防止 Ag/AgCl 电极与测试溶液直接接触。或者，必须使用 Ag/AgCl 材料的稳定非脆性成分，以避免此类颗粒释放到溶液中。此外，由于可能释放银纳米颗粒，必须考虑对相关生物系统的可能毒理学影响。
来源：Yakushenko, A., Mayer, D., Buitenhuis, J., Offenhäusser, A., & Wolfrum, B. (2014). Electrochemical artifacts originating from nanoparticle contamination by Ag/AgCl quasi-reference electrodes. Lab Chip, 14(3), 602–607. doi:10.1039/c3lc51029h